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O presente trabalho teve por objetivo estudar a aplicabilidade das DBS e suas vantagens no âmbito da toxicologia forense, a partir do desenvolvimento e validação de uma metodologia baseada nesta técnica de amostragem em combinação com a tecnologia UPLC-MS/MS, para a confirmação e quantificação de anfetaminas, opiáceos, cocaína, metadona e metabolitos, num total de 11 substâncias. As amostras DBS, preparadas a partir de um volume de sangue de 50 ƒÊL, foram extraidas com 3 mL de uma mistura metanol/acetonitrilo (3:1, v/v) ao qual foram adicionados os PIs. A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Acquity UPLCR HSS T3 (100 mm x 2,1 mm; 1,8 ƒÊm) e uma fase móvel formada por acetonitrilo e formato de amónio 2 mM (ácido fórmico 0,1%). A deteção foi concretizada com um espectrómetro de massa/massa triplo quadrupolo operando no modo de ionizacao ESI + e de aquisição MRM, com duas transições iónicas por substância. O método demonstrou ser seletivo e o efeito de matriz foi considerado não significativo, com exceção para a morfina e EDDP para as quais se observou uma supressão relevante do sinal, situação corrigida através da utilização dos respetivos análogos deuterados como PIs. A eficiência da extração apresentou recuperações entre 42% e 91%, e não se observaram fenómenos de arrastamento. Apesar do volume pequeno de amostra, a combinação com a técnica analítica de elevada sensibilidade permitiu atingir valores de LD e de LQ baixos, entre 0,5 – 1 ng/mL e 1 – 5 ng/mL, respetivamente. A linearidade foi estudada na gama de trabalho do correspondente LQ a 500 ng/mL, tendo-se obtido r2 superiores a 0,994, e selecionado o modelo da regressão linear ponderada com um fator de 1/x, para todas as substâncias. O método desenvolvido ofereceu bons resultados para a repetibilidade e precisão intermédia, com CV de 3,8 – 14% e 5,3 – 13%, respetivamente. A exatidão apresentou valores de bias entre -9,3% e 7,9%. A experiência para testar a integridade da diluição de amostras DBS cuja concentração é superior ao último calibrador, foi avaliada a uma concentração de 800 ng/mL tendo-se obtido recuperações entre 82% e 102% e CV 4,8%. Foi ainda realizado um estudo de estabilidade dos analitos nas DBS por um período de armazenamento máximo de 8 meses, a três temperaturas (temp. amb., 2-8ºC e -10ºC), tendo-se obtido os melhores resultados para as amostras a -10ºC, com valores de diferença percentual da concentração relativamente aos controlos positivos, inferiores ou iguais 15%, para todas as substâncias, e os piores resultados para as amostras armazenadas a temperatura ambiente com sinais de alterações evidentes, no caso, da morfina, 6-MAM, anfetamina, MDA, benzoilecgonina e cocaína. Após a validação, o procedimento foi aplicado a 64 amostras reais (correspondendo a 92 resultados positivos). Os resultados foram comparados com os obtidos a partir de metodologias utilizadas por rotina no SQTF, baseadas em amostras de sangue total preparadas por SPE e analisadas por GC-MS. Do tratamento estatístico realizado, concluiu-se que, tendo em conta o tipo e diversidade das amostras analisadas, a correlação obtida entre os resultados foi boa. O trabalho desenvolvido e os resultados obtidos neste estudo permitiram avaliar as possibilidades, benefícios e limitações da utilização da técnica de DBS na área da toxicologia forense, e concluir que apesar de ainda existir muito trabalho por realizar, os resultados são promissores e as DBS podem representar uma alternativa ou um complemento das técnicas analíticas e de amostragem convencionais, podendo dar resposta a algumas das questões presentes nas diferentes aplicações da toxicologia forense. |
